杂质无紫外吸收成限速步骤，几种常用衍生方法 帮你解决

传统化学方法，无法准确定量，怎么办？

示差检测器，蒸发光检测器，灵敏度低，满足不了检测限要求，怎么办？

LC-MS，价格昂贵，适用范围窄，怎么办？

在整个药品研发过程中，产品杂质研究是至关重要的一环，一些特殊杂质的检测往往会成为项目开展的限速步骤！成为困扰大家的绊脚石！

对于一些无紫外吸收的杂质，无法采用紫外检测器进行常规检测，传统化学显色方法无法准确定量；通用检测器灵敏度往往达不到要求；LC-MS、GC等仪器价格较贵，且对化合物种类有一定限制。今天，给大家介绍几种柱前衍生化法，或许可以为你提供新思路，助你解开难题！

（一）柱前衍生化法介绍

无紫外吸收或紫外吸收很弱的物质与带有发色基团或电化学活性基团的衍生化试剂反应，生成稳定的、具有紫外吸收的物质，可通过液相色谱（紫外检测器）进行检测的方法。

优点：

1.对用作流动相的溶剂体系没有限制；

2.反应条件、反应速率不受限制；

3.通过选择合适的试剂以及萃取方法，消除干扰；

4.过量溶剂、试剂容易除去；

5.转变成合适的衍生物，可使分离度改进。

缺点：

1.操作过程繁琐，容易影响定量准确性；

2.复杂组分样品衍生化反应后，有可能产生多种衍生化产物，

给色谱分离带来困难；

3.有时重现性不佳，不易连续化。

（二）常用的紫外衍生基团/试剂

（三）常见的衍生方法

1）对甲苯磺酰氯可与伯胺和仲胺反应

反应特点：

①伯胺和仲胺可与对甲苯磺酰氯反应，叔胺不与对甲苯磺酰氯反应；

②伯胺与对甲苯磺酰氯反应生成的对甲苯磺酰胺化合物易溶于碱性溶液；

③仲胺与对甲苯磺酰氯反应生成的对甲苯磺酰胺化合物不溶于碱性溶液；

反应优点：水浴55℃，水浴30min时能达到较高的衍生化效率，对甲苯磺酰胺化合物紫外响应极强，稳定性高，最大吸收波长229nm。

2）2，4 - 二硝基苯肼（DNPH）与羰基化合物（醛类和酮类中的羰基）反应

反应优点：在酸性条件下，在水浴60℃，水浴20分钟时能达到较高的衍生化效率。

3）苯甲醛/对二甲基苯甲醛与肼反应生成苯甲醛吖嗪/对二甲氨基苄连氮黄色化合物

反应优点：20分钟即可反应完全，反应转化率较高。

案例分享
1）案例一

研究思路：起始原料TGR-1D制备过程中可能会引入某致突变杂质，结构与TGR-1D相似，考虑将TGR-1D按照致突变杂质进行研究，TGR-1D无紫外吸收，GC/GC-MS等都无法达到目的，因此考虑采用对甲苯磺酰氯与结构中的伯胺进行柱前衍生，采用HPLC进行测定。

衍生方法：水浴55℃，衍生30分钟。衍生产物稳定，229nm有最大吸收。

结论：经方法学验证，方法稳定，衍生效率高，LOQ为0.36ng，为致突变杂质研究及无紫外吸收杂质研究提供一种研究思路。

2）案例二

研究思路：需要对起始原料乙醇胺进行研究，该化合物无紫外吸收，GC响应较弱，结构为伯胺，考虑采用对甲苯磺酰氯衍生生成对甲苯磺酰胺化合物，引入较强共轭，可采用HPLC进行测定。

衍生方法：水浴55℃，衍生60分钟。衍生产物稳定，229nm有最大吸收。

结论：经方法学验证，方法稳定，衍生效率高，LOQ为0.04ng，为无紫外吸收杂质研究提供一种研究思路。

药物研发过程中，对于一些无紫外吸收的杂质研究，可有多种方法，如GC、GC-MS/MS、LC-MS/MS、蒸发光检测器（ELSD）、电喷雾检测器(CAD)、柱前衍生等方法，各自方法均有优缺点。对于结构中有明显可衍生基团情况下可优先考虑衍生，但须兼顾其他杂质及主成分的干扰，另外需要兼顾检测成本，综合选择最优的方法有利于日常研究及监控。